André Julião | Agência FAPESP – Pesquisadores da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) desenvolveram um método que permite visualizar o material genético do novo coronavírus dentro de células. Baseado na técnica conhecida como hibridização in situ por fluorescência — FISH (fluorescent in situ hybridization) —, ele permite visualizar o vírus nas células em três dimensões e a marcação simultânea de outros componentes celulares.
O protocolo desenvolvido por pesquisadadores da Unicamp mostra o microorganismo se replicando na periferia do núcleo celular; metodologia ajuda a compreender a ação do SARS-CoV-2 e pode ser aplicada também no estudo de outros vírus . ( Imagem: Luana Nunes Santos/ Unicamp)
“Geralmente os laboratórios usam técnicas que permitem verificar o aumento da carga viral em uma cultura de células ou tecidos infectados, como o qPCR. No entanto, essas técnicas não comprovam que o vírus está dentro das células ou mesmo em que parte da célula ele se instalou, o que é muito importante na compreensão da doença”, diz Henrique Marques-Souza, professor do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp, que liderou o desenvolvimento do método.
Marques-Souza, que é apoiado pela FAPESP, faz parte da força-tarefa COVID-19 Unicamp, que une esforços de pesquisa, insumos e recursos para a compreensão e combate à doença. Com o protocolo, desenvolvido pela pós-doutoranda Luana Nunes Santos, será possível aprofundar os estudos sobre o novo coronavírus em andamento em seu laboratório, além de permitir a colaboração com outros grupos de pesquisas dentro e fora da Unicamp.
“Conseguir visualizar o vírus dentro da célula é algo muito valioso para a compreensão da infecção. Isso pode também ser realizado pela microscopia eletrônica de transmissão [MET] ou por imunocitoquímica [ICQ]. A MET, porém, demanda microscópios especializados e demora entre uma semana e 10 dias para ser concluída. Já a ICQ requer anticorpos que se ligam ao vírus, e é relativamente simples. No entanto, os insumos são caros e demoram muito para chegar por conta da alta demanda mundial provocada pela pandemia”, explica.
Na FISH, os pesquisadores sintetizam uma sonda, uma molécula de DNA que se liga ao RNA do vírus, o que permite a ligação de substâncias visíveis sob luz fluorescente. Ao entrar em contato com a célula infectada, a sonda se liga (hibridiza) especificamente com o RNA do vírus e as moléculas fluorescentes que a ela se ligam permitem a visualização da marcação em um microscópio de fluorescência.
Do ponto de vista logístico, os ensaios realizados pelo laboratório da Unicamp podem ser feitos com mais agilidade, porque não dependem da importação dos kits comerciais de FISH ou dos anticorpos usados na imunocitoquímica, o que representa também um ganho econômico. Outra vantagem é que o vírus pode ser detectado precocemente, uma vez que a imunocitoquímica depende do vírus replicar seu RNA e produzir um nível detectável da proteína viral.
O trabalho foi desenvolvido em parceria com o Laboratório de Estudos de Vírus Emergentes (LEVE), coordenado por José Luiz Proença Módena, e o Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABiC), sob coordenação de Hernandes Carvalho, ambos professores do IB-Unicamp. A pesquisa conta ainda o apoio da Pró-Reitoria de Pesquisa (Faepex) da Unicamp
Ação do vírus
As imagens em três dimensões feitas até agora mostram que o vírus se replica próximo ao núcleo da célula, provavelmente se instalando em alguma organela específica, como o endossomo. Os pesquisadores estão aplicando essa técnica para responder a diferentes questões do mecanismo de infecção do novo coronavírus e os primeiros resultados encontram-se em vias de serem submetidos para publicação.
O trabalho abre caminho ainda para aplicação no estudo de outros vírus, inclusive para traçar paralelos entre eles e o SARS-CoV-2. “Tudo o que descobrirmos sobre a dinâmica do vírus dentro da célula podemos adaptar para comparar com outros vírus mais comuns, como o da gripe. Com isso, talvez seja possível entender por que o novo coronavírus é tão agressivo”, diz Marques-Souza.
Embora não seja o foco no momento, o trabalho também pode resultar no desenvolvimento de um novo teste de detecção do vírus no futuro.
O novo protocolo foi testado em células Vero, originárias de rim de macaco, modelo mais usado em estudos de coronavírus. Os testes também foram bem-sucedidos em células pulmonares e em outras células humanas, deixando evidente a versatilidade da técnica.